品系名称：NOD/ShiLtJGpt-Prkdc^em26Cd52Il2rg^em26Cd22/Gpt

品系类型：Knock out

品系编号：T001475

品系背景：NOD/ShiLtJGpt

1. 品系描述

NCG (NOD/ShiLtJGpt-Prkdc^em26Cd52Il2rg^em26Cd22/Gpt)是使用基因编辑技术敲除了NOD/ShiltJGpt小鼠的Prkdc(Protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide)及Il2rg（Common gamma chain receptor）基因而获得的重度免疫缺陷品系。NOD/ShiltJGpt遗传背景使该品系具有天然免疫缺陷，如补体系统、巨噬细胞缺陷，同时，该背景Sirpa与人类CD47具有高亲和力，使NOD/ShiltJGpt比其它品系更适合人源移植物（如：肿瘤和人源细胞）的定植。 Prkdc基因功能缺失导致V(D)J重组不能正常发生，造成T细胞和B细胞不能发育成熟。IL2RG是多种白细胞介素细胞因子受体的共同亚基，IL2RG失活则导致6种不同细胞因子信号通路缺失，造成NK细胞缺陷。因此，NCG是迄今为止免疫系统缺陷最为彻底的91香蕉视频导航 之一，非常适合人源肿瘤细胞移植（CDX）、人源肿瘤组织移植（PDX）、人外周血单个核细胞（PBMC）及人源造血干细胞（CD34+ HSC）移植进行免疫重建。NCG生存周期长（>89周），利于长期移植及药效学评价。

2. 应用领域

(1)    人源免疫重建91香蕉视频导航 ，如BLT人源化小鼠、PBMC人源化小鼠及CD34+人源化小鼠;

(2)    人源肿瘤细胞、肿瘤组织移植（CDX，PDX）;

(3)    药效评价（小分子、大分子、联合用药）;

(4)    人类癌症模型;

(5)    干细胞研究

3. 验证数据

（1）NCG免疫细胞分群检测图

图1 NOD（NOD/ShiltJGpt）、NOD-scid及NCG小鼠T/B/NK细胞比例检测

取5周龄NOD（NOD/ShiltJGpt）、NOD-scid及NCG雌鼠脾脏细胞进行流式检测，测定其T细胞（CD3+）、B细胞（CD19+）、NK细胞（CD335）及成熟B细胞（IgM+）比例。结果显示，与NOD相比，NOD-scid几乎没有T、B细胞，NK细胞比例代偿性上升。与NOD相比，NCG几乎没有T、B、NK细胞，免疫缺陷比NOD-scid更为彻底。

图2 C57BL/6和NCG小鼠DC/Macrophage/Neutrphil/Monocytes细胞比例检测

取5周龄C57BL/6和NCG雌鼠脾脏细胞进行流式检测，测定其DC细胞（CD11c）、Macrophage细胞（F4/80）、Neutrphil细胞及Monocytes细胞比例。结果显示，与C57BL/6相比，NCG几乎检测不到DC、Macrophage细胞，Neutrphil细胞和Monocytes细胞比例代偿性上升。

4. NCG小鼠在CDX中应用

图3 人乳腺癌细胞系BT474和MCF-7在Nu/Nod-scid/NCG小鼠上的成瘤性测试

将对数生长期的人乳腺癌细胞系BT474和MCF-7接种至6-8周龄的Nu/Nod-scid/NCG小鼠皮下，随着时间肿瘤的大小呈梯度曲线增长。（肿瘤体积数值以Mean±SEM表示）

5. NCG小鼠在PDX中应用

图4 结肠癌肝转移癌瘤（PDX）在NCG小鼠上的成瘤性测试，以及PDX标本切片结构

P1：患者肿瘤组织接种至NCG小鼠体内生长的第一代模型；P2：P1代肿瘤模型再次传代至其他NCG小鼠体内生长的第二代模型；由于穿刺样本量很少，生长速度较慢，P2代的生长速度明显提高。PDX标本代次之间均保留了高度分裂相细胞类型。

图5 基于接种结肠癌肝转移癌瘤在NCG小鼠上的药效测试

与对照组G1相比，吉西他滨处理组、伊立替康处理组瘤重均有显著性下降。

6. 免疫重建

免疫系统人源化小鼠是指在重度免疫缺陷小鼠（如NCG）体内移植人的造血细胞、淋巴细胞或组织，获得具有人源免疫系统的91香蕉视频导航 ，包括huPBMC-NCG和huHSC-NCG小鼠。免疫系统人源化小鼠结合CDX或PDX造模，可用于研究人类免疫系统环境下肿瘤的生长，评价抗肿瘤治疗方案，尤其是助力基于免疫治疗的新药开发。

（1）huPBMC-NCG  

huPBMC-NCG小鼠是将人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）移植到重度免疫缺陷小鼠NCG体内，从而获得的重建人免疫系统的NCG91香蕉视频导航 。在NCG小鼠上进行的huPBMC免疫重建效率高，速度快，重建后以淋巴T细胞为主，可用于多种肿瘤免疫药物的评价。huPBMC-NCG小鼠免疫重建后生存周期为5-7周，给药周期相对较短。由于T细胞重建速度非常快，人源T细胞会识别并攻击小鼠组织从而发生移植物抗宿主病（GvHD），因此该模型可以用来评价GvHD药物。由于huPBMC供体之间的差异性明显，为排除不同供体来源的PBMC对实验结果的影响，需要通过筛选Donor，保证huPBMC-NCG免疫重建的稳定性。

图6 huPBMC-NCG小鼠的生存曲线

分别将来源于供体F和供体G的huPBMC注射到NCG小鼠中，分析huPBMC-NCG免疫重建小鼠的存活时间。由于植入的PBMC为异源免疫细胞，huPBMC-NCG小鼠会随着时间推移产生GvHD，缩短了huPBMC-NCG小鼠的使用窗口期。本研究发现NCG小鼠移植huPBMC一个月左右陆续出现死亡。

图7 huPBMC-NCG免疫重建水平

利用流式细胞技术检测huPBMC-NCG小鼠人源化进程中外周血中人白细胞比例。随着时间推移，huPBMC-NCG小鼠外周血中人白细胞的比例逐渐增加，第三周时平均人白细胞比例超过50%。huPBMC-NCG免疫重建速度快，重建细胞以CD3+T细胞为主。数据以Mean ±SEM形式呈现。

图8 基于huPBMC-NCG小鼠体内药效试验

基于huPBMC-NCG小鼠体内GvHD药效研究分别使用两种不同Donor来源的huPBMC细胞构建huPBMC-NCG，并接种PDL1高表达细胞系MDA-MB-231构建皮下荷瘤模型。PBMC接种后会影响MDA- MB-231在NCG体内的成瘤速度。待肿瘤生长至平均体积约100 mm³时随机分为Vehicle（对照）组及Tecentriq给药组，使用相应药物进行治疗。每周给药2次，连续给药三周。结果显示Tecentriq对肿瘤生长有明显抑制作用（PBMC-01，TGI=45.41%；PBMC-02，TGI= 56.96%）。数据以Mean ± SEM形式呈现。

图9 小鼠在重建后会出现GvHD表型，弓背，炸毛现象

图10 基于huPBMC-NCG小鼠评价GvHD药物

将huPBMC尾静脉移植至辐照处理后的NCG小鼠（辐照会加速GvHD的反应），然后给药GvHD药物治疗。结果显示GvHD药物延长了huPBMC-NCG小鼠的生存周期，且随着给药剂量的增加，生存周期明显延长，体重增加。

（2）huHSC-NCG

huHSC-NCG小鼠是将人造血干细胞(CD34+HSC）移植到辐照清髓的重度免疫缺陷小鼠NCG体内，并分化产生各类造血或者免疫细胞，如T细胞、B细胞以及NK细胞等，从而获得免疫系统人源化的模型，重建后的免疫细胞类型较PBMC人源化小鼠丰富。以NCG小鼠为受体鼠，构建huHSC-NCG人源化小鼠。

NCG小鼠移植CD34+HSC后，相对于huPBMC重建速度慢，GvHD发生延迟，生存周期超过39周，延长了给药窗口期。huHSC-NCG小鼠的免疫重建效率高，主要重建T细胞和大量未成熟的B细胞，以及少量NK细胞和巨噬细胞等，可用于进行肿瘤免疫治疗药物的评价。

图11 huHSC-NCG小鼠人源化模型实验设计流程图

图12 NCG小鼠清髓效果检测

利用流式细胞技术检测辐照清髓效果。辐照可以清除小鼠骨髓中的造血干细胞，从而提高人源HSC移植后的重建水平。辐照后mCD45+mCD117+细胞群体比例为1.11%，显著低于未辐照组（13.5%）。

图13 HuHSC-NCG小鼠的生存曲线及体重变化情况

左图表明huHSC-NCG小鼠存活时间可超过37周，且生存率与NCG野生型小鼠无明显差异。右图huHSC-NCG小鼠体重随时间变化呈增长趋势，与NCG野生型小鼠体重无显著差异。

图14 huHSC-NCG重建效果鉴定

huHSC-NCG小鼠的免疫重建效率高，主要重建T细胞和大量未成熟的B细胞，以及少量NK细胞。

图15 基于huHSC-NCG91香蕉视频导航 的体内药效评价

基于huHSC-NCG小鼠体内用药试验。将对数生长期人淋巴瘤细胞Raji细胞接种到huHSC-NCG小鼠皮下，待肿瘤生长至平均体积约40-50 mm³时，随机分为Vehicle组，Tri-TE给药组，Blincyto给药组，并使用相应的药物进行治疗。结果显示：Tri-TE组（TGI=62.04%）及Blincyto给药组（TGI=51.14%）对huHSC-NCG的Raji细胞荷瘤鼠上肿瘤生长有抑制作用。

7. NCG在CAR-T治疗上的应用

嵌合抗原受体细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor T Cell，CAＲ-T）是肿瘤过继免疫治疗的新方法。CAR-T细胞具有靶向识别肿瘤抗原的能力，其杀伤肿瘤细胞无需进行抗原递呈，与以往免疫疗法相比，具有特异性高、攻击持久等优势。在恶性肿瘤，特别是血液肿瘤治疗中有很好的疗效。香蕉视频下载地址具有丰富的CDX和自主知识产权的PDX库，包括多种实体瘤和血液瘤，为CAR-T药效评价提供了丰富的肿瘤模型资源。同时，香蕉视频下载地址开发了外周血中CAR-T细胞绝对计数方法和细胞因子检测方法，满足CAR-T实验检测需求。

Nalm6-Luciferase细胞尾静脉接种到NCG小鼠后，第7天根据肿瘤负荷进行分组，分别给予Control T，CAR-T1及CAR-T2细胞治疗，并于D12，D19，D26利用活体成像技术检测肿瘤负荷。据体内成像及统计结果显示，与Control T相比，CAR-T1和CAR-T2细胞均能很好的抑制小鼠体内肿瘤生长，延长小鼠生存期。

8. NCG小鼠的生长曲线

9. 血常规

10. 血生化

11. 流式细胞

12. 已发表文献

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