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斑点鼠助力科学研究——通过cGAS-STING途径发挥作用的新型灭活全细胞铜绿假单胞菌疫苗被发现

铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)感染仍然是全球公共卫生的主要威胁,需要新的安全有效的疫苗来预防由铜绿假单胞菌引起的感染。铜绿假单胞菌PAO1(P. aeruginosa PAO1)是一种广泛用于制备疫苗的实验室菌株,X射线灭活的PAO1(XPa)上清液中发现了核酸和8-羟基鸟苷(8-OHG)。XPa在体外刺激了DCs(dentritic cell)中的cGAS-STING通路和Toll样受体,DC最终发生了凋亡和细胞焦亡。在体外,由XPa刺激的DC诱导CD8+T细胞增殖并在体内产生免疫记忆。XPa保护肺炎模型中的小鼠免受PAO1或耐多药临床分离株W9的感染。

 

2021年10月,四川大学华西医院生物治疗与癌症中心国家重点实验室王震玲团队在Signal Transduction and Targeted Therapy发表了题为“A novel inactivated whole-cell Pseudomonas aeruginosa vaccine that acts through the cGAS-STING pathway”的文章。该研究采用香蕉视频下载地址Tlr4-KO(B6/JGpt-Tlr4em26Cd1829/Gpt)小鼠,报道了一种抗铜绿假单胞菌感染的X射线灭活全细胞疫苗的新机制。

 

正文

 

1、X射线辐照诱导PAO1核酸释放

团队通过透射电子显微镜观察了X射线照射后PAO1的形状。PAO1细胞显示出一致的密度,DNA分子和电子光物质几乎随机分布在细胞的所有部位。同时测试了XPa和PAO1上清液中核酸和8-OHG的浓度,核酸浓度从25.4±0.5ng/μL显著增加至319.4±3.6ng/μL(约13倍)。8-OHG的浓度从50.02 ± 0.63 ng/mL显著增加至261.90 ± 35.18 ng/mL(约5倍)。表明细胞中的核酸被X射线照射破坏并释放到细胞外环境中。

 

图1. XPa的形态和生化特征


2、XPa调节DC功能

在XPa刺激后评估了骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的功能。DCs在XPa刺激后显著上调CD86、CD80和MHCII表达。成熟的DCs表现出下调的吞噬能力,DC将处理过的抗原呈递给T细胞,并在抗原特异性T细胞反应期间引发T细胞增殖。

图2. XPa对DC功能的影响

 

3、XPa激活DCs中的STING

通过XPa刺激的BMDCs中的免疫荧光染色观察了STING的运动。与XPa一起孵育的 DC显示出细胞形态的改变(形成伪足),通过慢病毒感染构建了293T-STING-GFP细胞,并用XPa刺激细胞3h后,发现细胞核周围有凝聚的绿色荧光。在293T-STING-GFP中,STING 定位于内质网(ER)。为了证实STING途径的激活,将IFN-β启动子-荧光素酶(Luc)质粒转染到293T-STING-GFP中,293T-STING-GFP-Luc细胞在受到 cGAMP(STING激动剂)刺激时产生高荧光素酶强度(160.5±3.54),在XPa刺激时产生的强度为63.5±2.12,约为cGAMP的40%。表明XPa激活了cGAS-STING途径。

图3. XPa激活BMDCs中的STING

4、XPa激活cGAS-STING通路

由于全细胞疫苗含有多种抗原,XPa的作用机制涉及复杂的通路,包括MyD88非依赖性途径(cGAS-STING)和MyD88依赖性途径(TLRs)。研究中,Pepinh-MyD(MyD88抑制剂)和sicgas(cgas的siRNA)用于分析XPa激活的BMDCs中TLR和cGAS-STING途径的影响,表明DCs对XPa的反应主要取决于cGAS-STING和TLR,并且cGAS-STING占主导地位。

图4. XPa刺激的DCs中激活的通路以及免疫和感染过程中的免疫反应


5、DCs凋亡和焦亡

研究中,XPa刺激后BMDCs经历了细胞凋亡和细胞焦亡。Caspase 3为细胞凋亡的标志物,Caspase 11为细胞焦亡的标志物,在XPa刺激后,Caspase 3在几乎所有的DCs 中都有表达,但只有少数DCs表达Caspase 11。表明细胞凋亡和细胞焦亡共同调节XPa 引发的免疫反应,细胞凋亡是主要结果。

图5. XPa体外免疫后DCs的发展

6、XPa诱导的记忆T细胞

为了探索T细胞类型对疫苗免疫反应的变化,团队在一次XPa免疫后两周收集了小鼠的血液、左腹股沟淋巴结和脾脏,测试了CD8+T细胞和CD4+T细胞比例, CD8+T细胞在淋巴结和脾脏中增加,血液中没有增加。XPa免疫两周后,淋巴结中的CD8+TEM减少,但CD4+T细胞的数量没有变化。CD4+ TCMs在淋巴结中的比例增加,而在血液和脾脏中保持不变。

图6. 体内T细胞和炎症因子

 

7、XPa保护肺炎模型中的小鼠免受PAO1或W9的感染

XPa在由PAO1引起的急性细菌性肺炎91香蕉视频导航 中表现出积极的保护作用。在用PAO1感染后,WT小鼠在第2天全部死亡,XPa处理的动物体重没有观察到差异。

图7. 疫苗对小鼠的保护作用

 

结论

文章研究了一种名为XPa针对铜绿假单胞菌的灭活全细胞疫苗。XPa在由PAO1或W9诱导的小鼠急性肺炎模型中显示出良好的保护作用。比较了cGAS-STING和TLRs通路,发现了一种针对铜绿假单胞菌感染的辐照灭活全细胞疫苗的新机制。

 

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